文献解读|Cell Rep（9.995）：α1 抗胰蛋白酶杂合性的人 iPSC 肝细胞模型揭示了代谢失调和细胞异质性

研究者团队将 CRISPR-Cas9技术与单链寡脱氧核苷酸 (ssODN) 供体模板结合使用，引入了一个或两个包含 Z 或野生型 (M) 序列的 ssODN 供体，成功地靶向了 3 个遗传上不同的 ZZ iPSC 系 (PiZZ1、PiZZ6 和 PiZZ100), 建立了 3 个同基因组的 ZAAT 纯合子 (ZZ)、杂合子 (MZ) 和野生型 (MM)的 iPSC，之后成功定向分化为iHeps (图1A-B)。通过流式细胞术、抗体染色的平均荧光强度 (MFI) 和脉冲追踪35S-Met/Cys 放射性标记，以表征新生AAT蛋白的合成和分泌动力学，结果显示，与基因匹配的 MM 对照相比，MZ iHeps 表现出异常的 AAT 合成、保留和分泌 (图1C-K)。

图1. 来自 CRISPR-Cas9 编辑的 ZZ iPSC 的同基因 MZ 和 MM iHeps 的表征。

(A) 建立AAT模型。(B) iHeps 的定向分化。(C) ZZ、MZ 和 MM iHeps 的流式细胞术图。(D) ZZ、MZ 和 MM iHeps 中细胞内 AAT 蛋白的平均荧光强度。(E/F)免疫染色。(G/H) ZZ、MZ 和 MM iHep 上清液中分泌的总AAT 和ZAAT 蛋白。(I) 浓缩 iHep 上清液中抗中性粒细胞弹性蛋白酶抑制的测定。(J/K) 对35S-Met/Cys 标记AAT 蛋白分泌动力学的量化。

使用高通量 RNA 测序，研究者团队分析了源自亲本系“PiZZ6”的同基因 ZZ、MZ 和 MM iHeps 的转录组。主成分分析 (PCA) 显示了三个不同的AAT基因型聚类(图2A)，在三组两两比较中，差异表达基因(DEGs)的总数显示，与MM iHeps相比，ZZ(1308)或MZ(736)之间的DEGs多于彼此之间的DEGs (图2B)。之后又比较已知调节脂质稳态的转录因子的相对表达，发现与 MM iHeps 相比，ZZ iHeps 中包括HNF1A、HNF4A、CEBPA、PPARA、CREB3L3和RXRA在内的多种因子显著下调 (图2C)。而接下来又通过基因集富集分析(GSEA)发现在 MZ 和 ZZ iHeps 组中，与血管生成、细胞凋亡、转化生长因子 β (TGF-β) 和上皮间质转化 (EMT)相关的基因显著富集 (图2D-E)。相反，MM iHeps 组富集了与传统肝细胞生物学相关的通路，包括胆汁酸代谢、外源性代谢、凝血和脂肪酸代谢。

鉴于正常稳态线粒体和 ER 功能在蛋白质合成和肝细胞代谢调节中的重要性，研究者团队研究了与 ER 或线粒体功能障碍相关的通路，发现 ZZ 和 MZ iHeps 都在 GO 分析中发生了富集 (图2F)，例如参与线粒体功能通路和 PERK 介导的未折叠蛋白反应 (UPR)，表明两种细胞器的功能障碍。这些数据证明 AAT 的Z单等位基因表达足以扰乱整体肝转录组并引起代谢失调。

图2. RNA-seq 表明单个 Z 等位基因能引起整体转录组失调

(A) 主成分分析 (PCA)。(B) ZZ、MZ 和 MM iHeps 之间的差异表达基因 (DEG)的火山图。(C) 肝脏脂类代谢转录因子的热图。(D) 基因集富集分析 (GSEA)，包括已发布的 ZZ 与 MM iHeps 数据集，用于比较 (FDR < 0.1)。(E) ZZ 和 MZ iHeps 的前 5 个上调和下调最多的基因集与 MM iHeps 相比，按归一化富集分数 (NES) (FDR < 0.05) 排序。(F) NES (FDR < 0.25)前 5 的 ER 和线粒体相关的 GO 分析。

研究者团队接下来对代谢组进行表征，发现与 MM iHeps对照组相比，MZ 和 ZZ 组中的支链氨基酸 (BCAAs) 和短链酰基肉碱均有所升高，而 ATP、乳酸、还原型谷胱甘肽 (GSH)、氧化型谷胱甘肽 (GSSG) 和长链酰基肉碱均下降，且参与尿素生成的多种代谢物包括亚精胺、N-乙酰谷氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸和精氨酸在 MZ 和 ZZ 中的积累有差异(图3A)。

之后使用代谢物集富集分析 (MSEA) 和代谢途径分析 (MetPa) 分析了差异表达的代谢物，发现在表达 ZAAT 的 iHeps 中与能量密集型途径相关的多种代谢物发生了显著减少(图3B-D)，包括丙氨酸和硫胺素代谢、尿素循环和精氨酸生物合成，以及烟酸盐和烟酰胺代谢产物 (NAD/ NADH)。重要的是，通过代谢组学分析发现了在MZ 和 ZZ iHeps中富集了其他途径相关的代谢物(图3C-D)，包括将乙酰基转移到线粒体和氨酰-tRNA 生物合成，以及支链氨基酸 (BCAA) 生物合成和还原型谷胱甘肽(GSH) 的变化，这些都与诱导ER 应激或慢性肝病相关。总之，代谢组学分析表明 ZAAT 引起的的 ER应激和线粒体损伤会改变稳态肝功能过程，包括尿素循环和氧化还原途径，并改变 MZ 和 ZZ iHeps 中的蛋白质合成。

图3. 代谢组学分析发现 ZAAT 表达细胞中代谢途径失调。

(A) 酰胺和脂质组分前 50 种差异积累代谢物的热图。(B) ZZ 与 MM iHeps 的代谢物集富集分析汇总图显示按 P 值排名的前 5 的代谢途径。(C) ZZ 与 MM iHeps 通路富集分析的代谢组预测。(D) 尿素循环相关酶的 RNA 表达热图。

为了确定杂合表达ZAAT的细胞在转录水平上是否存在异质性，研究者团队对来自PiZZ1供体的同基因ZZ、MZ和MM iHeps以及来自PiZZ6供体的额外ZZ样本(PiZZ6ZZ)进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。他们应用均匀流形近似和投影 (UMAP)以及 Louvain聚类(Louvain clustering) 并鉴定了6个簇，其中四个由 ZZ 和 MZ 细胞的混合物组成，一个几乎完全由 MM 细胞组成(图4A-B)。他们将每个簇的前 50 个 DEGs 与Hallmark 基因集的富集进行了比较(图4D-E), 并且将表达ZAAT的簇注释为纤维化(cluster 0); 分泌性(cluster 1); 增殖性(cluster 3); 线粒体的 (cluster 4); 酶促的 (cluster 5)。这些数据表明在表达突变体 ZAAT 的 iHeps 中存在转录异质性，其特征是在 MZ 和 ZZ 细胞集中表达促纤维化基因(如COL4A1和COL4A2) (图5D-F)，这种异常表达模式进一步伴随着未折叠蛋白反应 (UPR) 的三个分支(ATF6 和 IRE1/XBP1s)的相对下调以及纤维化相关PERK 效应基因的上调(图5G，5J-K)。

图4. scRNA-seq 展示了表达 ZAAT 的 iHeps 中具有分支特异性 UPR 激活的转录异质性

(A) UMAP和 Louvain 聚类鉴定 6 个簇。(B) 6 个 Louvain 聚类的组成。(C) 6 个簇中选定的肝、胆管上皮和星状基因的平均表达和频率。与公开可用的人类肝脏 scRNA-seq 数据集进行了比较。(D) 按倍数变化 (FC) (FDR < 0.001) 排列的每个簇的前 50 个 DEG。(E)每个簇排名前两个 Hallmark 基因集。(F) 选择集群特定相关 DEG 的 UMAP。(G) 由 FC 排名的前 20 个 DEG。(H) HSPA5 (BiP) 簇表达的小提琴图。(I) GO 分析。(J) cluster 0 和 cluster 1 的 PERK、ATF6 和 IRE/XBP1s 模块分数的小提琴图。(K) PiZZ1ZZ的 UPR 分支特异性基因的点图预测。

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