文献解读|CANCER IMMUNOL IMMUN（6.968）：非小细胞肺癌患者PD-1单抗治疗过程中外周T细胞克隆的动态变化

阻断PD-1可以实现T细胞功能的部分恢复，但具有个体差异。最初通过肿瘤浸润CD8+ T细胞的计数评价免疫改善情况，随后更多研究强调T细胞功能评估，同时也有文献指出T细胞反应恢复与治疗前肿瘤负荷相关。

既往研究使用肿瘤的基因组、大规模RNA测序对非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤浸润T细胞功能进行评估，仍缺乏对肿瘤微环境中单个免疫细胞相互作用的证据支持，而单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）能够较好克服这一限制。本研究收集NSCLC患者在使用PD-1单抗治疗前后外周血中T细胞，进行大规模Smart-seq2单细胞测序，结合T细胞受体（TCR）全长序列鉴定、组织TCR β DNA测序、循环肿瘤DNA测序等技术手段，研究PD-1单抗治疗期间外周T细胞的的动态变化。

共纳入4例接受纳武单抗（百时美施贵宝PD-1抑制剂OPDIVO）治疗的NSCLC晚期患者，其中Pt1、Pt2、Pt4为腺癌，Pt3为鳞状细胞癌。Pt1、Pt2和Pt3治疗初期有应答，随后疾病进展。Pt1在12周后获得部分缓解，而Pt2和Pt3在治疗期间只实现肿瘤不进展。Pt1、Pt2和Pt3的无进展生存期分别为4.3个月、8.5个月和11个月。Pt4对纳武单抗治疗无应答。患者治疗前组织活检的免疫组化显示，Pt1、Pt2、Pt3组织有不同程度PD-L1表达，Pt4组织不表达PD-L1，组化结果与治疗反应性结果相一致。

根据RNA-seq确定每个患者的人类白细胞抗原I类（HLA-I）基因型，并在治疗前外周循环肿瘤DNA中识别体细胞突变。结合HLA-I基因型和突变数据，预测了每个患者的独特的肿瘤新抗原。应答患者中每人至少发现了一个新的抗原，而在Pt4未发现新的抗原，新抗原预测与治疗反应性结果相一致。

免疫应答三名患者在治疗前、治疗期期间、直到肿瘤进展，分别收集血液样本。Pt4只采集了治疗前的外周血。对收集标本进行scRNA-seq，获得共计3 110个CD8+和CD4+T细胞，经过质控和筛选最终保留3 042个（97.8%）细胞用于后续分析，其中包括1 624个CD8+T细胞和1 418个CD4+T细胞。

附：

部分缓解：靶病变减少30%以上;

进展性疾病：靶病变增加20%以上;

稳定型疾病：病灶大小在部分缓解和进展型疾病之间的变化。

对scRNA-seq聚类分析，获得4个细胞簇（图1），包括初始CD8+T细胞、效应CD8+T细胞、初始CD4+T细胞和效应CD4+T细胞。初始T细胞中的特异性地表达“naive”特征基因；效应细胞簇高表达T细胞功能相关基因，例如：GZMA、GNLY、PRF1、GZMB。在PD-1单抗治疗过程中，应答患者中效应CD8 +T细胞和效应CD4 +T细胞的百分比下降。

图1 4个患者的3042个单个T细胞的t-SNE，显示了4个以不同颜色显示的主簇的形成；不同细胞簇的特征基因

所有细胞中，6.0%的CD8+T细胞和10.5%的CD4+T细胞为PD-1阳性，与既往文献结果一致。在三个应答者中，随着肿瘤的进展，效应CD8+细胞簇中的PD-1+T细胞增加。治疗后，Pt1、Pt2和Pt3患者外周效应细胞中PD-1+群体所占百分比呈现不同的变化模式（图2）。

图2 每个T细胞群中PD-1+T细胞的百分比；三个应答患者在每个时间点的PD-1+T细胞百分比

Ki-67为增殖标记物，既往文献报道接受ICB治疗的患者，在疾病继续进展的过程中，瘤内浸润T细胞的Ki-67阳性率逐渐降低。然而，在本研究中仅仅2%左右T细胞表达Ki-67，并且没有随着治疗或者疾病进展下降。

TCR可以用来定义T细胞谱系，具有相同αβ链的T细胞被来自同一个T细胞克隆。本研究拼接TCR α-链和β-链的全长，并测定外周T细胞的TCR序列。其中78.0%的T细胞具有成对的TCR αβ链，这些配对TCR属于1 379个克隆。

克隆性扩增的T细胞是指同一种TCR至少存有2个细胞，大量克隆性扩增T细胞是指同一种TCR至少有6个细胞。测序到的所有细胞中的大量克隆性扩增T细胞全部来自效应T细胞。具体表现为不同的T细胞群表现出不同的克隆性扩增。效应细胞中，克隆性扩增的CD8+T、CD4+T细胞均占该簇细胞的一半以上；初始细胞中，克隆性扩增的CD8+T、CD4+T细胞占该簇细胞不到3%。PD-1单抗治疗后，Pt2和Pt3组的克隆性T细胞比例增加。随着肿瘤的进展，克隆性T细胞在不同患者中变化不一致。

图3 扩增的T细胞克隆的细胞数，仅显示有≥4个细胞的克隆，钻石代表与肿瘤相关的克隆

对治疗前的PT1和PT4的肿瘤组织进行了多细胞TCRβ链DNA测序。在患者的肿瘤组织中能够检测到与外周血相同的TCRβ序列，则将外周血中的T细胞定义为与肿瘤相关T细胞。在Pt1中，约三分之一CD8+和CD4+T细胞与肿瘤有关，而在PT4中，仅有不到5%的CD8+和CD4+T细胞与肿瘤有关。这些结果表明，应答者的血液T细胞比无应答者的T细胞更有可能由外周进入肿瘤组织。

图4 在应答者Pt1和无应答者Pt4中，肿瘤相关T细胞在每个细胞簇中的百分比

以Pt1样本为例，患者外周血中的效应性T细胞与肿瘤浸润性T细胞相关性强。在Pt1外周血中的前十个TCR克隆中，七个与肿瘤有关。在Pt1的肿瘤进展后，肿瘤相关的效应CD4 +T细胞的比例急剧下降，同时与肿瘤相关的效应CD8+ T细胞的比例略有增加。并且CD4+T细胞克隆具有更高的反应性。这些结果表明，肿瘤相关的CD4+T细胞隆在肿瘤杀伤中可能发挥了更重要的作用。

重点研究整个细胞总数1%以上的克隆性扩增T细胞的丰度变化。在Pt1中，克隆性扩增CD4+T细胞均可以在肿瘤组织中检出，克隆性扩增最多的为TCR2 CD4+T细胞，同时TCR2克隆为所有克隆中PD-1阳性率最高，并且随疾病进展比例下降。CD4+T细胞克隆TCR2可能对PD-1的阻断有直接反应，疾病进展期比例降低可能影响了治疗效果。

比较应答者治疗期间和进展中的基因表达差异，其中包括18个CD8+T细胞克隆和9个CD4+T细胞克隆。检测到524个差异表达基因，不同患者的T细胞克隆之间存在不同的模式。CXCR4、DUSP2和ZFP36等T细胞功能相关基因在疾病进展后上调。

图5 热图，显示单个T细胞克隆中正在治疗和进展时间点之间的差异基因；T-SNE图中展示不同细胞的差异基因表现

Pt3患者TCR1T细胞克隆的丰度在治疗过程中下降，疾病进展后几乎无变化，评估该克隆中的表达谱变化。疾病进展期与治疗前相比，细胞有相反分化发育方向（图6）。基于拟时序分析的差异基因进行GSEA富集分析， “白细胞跨内皮细胞迁移”通路基因上调， “细胞因子和细胞因子受体相互作用”通路基因下调。这些结果提示，尽管克隆TCR1进展期间在外周中的丰度仍较高，但是细胞因子的下调可能导致疾病进展后的功能障碍。

图6 T细胞克隆TCR1的在t-SNE图位置；T细胞克隆TCR1的拟时序分析；通过拟时序分析推断不同时间点的细胞在伪时间内的分布