自噬（13.391）：甲状腺激素通过MTOR信号通路介导线粒体自噬并促进线粒体生成以增强棕色脂肪活性

首先，作者作出初步假设，T3能促进小鼠脂肪组织产生自噬，并通过检测甲亢小鼠棕色脂肪组织中自噬发生的标志性蛋白SQSTM1/p62以及MAP1LC3B-II的表达水平(图1 A)，以及自噬小泡数量的增加来说明T3确实促进了自噬的发生(图1 B)，并且这种促进作用与T3作用时间和剂量呈依赖关系(图1 C)，为了增强说服力，排除事件发生的或然性，作者进一步结合体外实验，利用T3处理小鼠原代棕色脂肪细胞后检测自噬小泡数量以及自噬流，发现T3在体外试验中同样能促进自噬的产生(图1 D-G)。

图1 T3诱导BAT和原代棕色脂肪细胞中的自噬通量增加

接着，因为作者此前研究发现T3能在骨骼肌和肝脏中诱导线粒体自噬，由于棕色脂肪组织（BAT）同样含有大量线粒体，于是便通过类比推测T3在BAT中同样能诱导线粒体自噬以维持线粒体的动态平衡，为了验证这一设想，作者利用自噬专一性抑制剂Chloroquine (CQ)处理甲亢小鼠BAT后，检测线粒体标志蛋白COX411以及TOMM20蛋白表达水平发现(图2 A)，与未处理的甲亢小鼠相比，CQ处理组的这两个蛋白表达水平增加，也就是说T3促进线粒体自噬的效果被CQ抑制，联合其他实验结果(图2 B-E)，说明T3确实能促进线粒体自噬。

图2 T3增加了BAT和原代棕色脂肪细胞的线粒体自噬水平

然而，由于甲亢小鼠的一个重要表型是产热量较正常小鼠高，而线粒体是产热的重要来源，T3处理后，线粒体因自噬而导致数量减少，逻辑上的结果是使得甲亢小鼠产热减少，与实际观察到的事实不符，那么是否就说明作者原本的假设被证伪了呢？于是作者进一步设想T3是通过同时促进棕色脂肪中新的线粒体的产生以及衰老、损伤线粒体的清除以起到促进产热的作用。实验结果也表明，T3确实能促进线粒体的合成（图3），在甲亢小鼠BAT中，产热基因UCP1、Prdm16、Ppargc1a、脂肪酸氧化及脂解相关基因Cpt1b、Acsl1 线粒体蛋白Lipe、Pnpla2表达增加（图3 A-C），同样，在体外，T3作用下，原代棕色脂肪细胞中产热以及线粒体相关基因与蛋白表达增加（图3 D-E）。那么，如何才能说明T3促进线粒体生成的能力强于促进线粒体分解的能力呢？作者采用了一种能特异性报告线粒体的荧光质粒（pMitoTimer plasmid），这种质粒能使得新生线粒体发出绿色荧光，成熟线粒体发出红色荧光，结果发现T3处理棕色脂肪细胞后，随时间推移，绿色荧光数量逐渐增加，而红色荧光数量逐渐减少，即新生线粒体逐渐变多，成熟线粒体逐渐减少，说明T3促进线粒体生成作用占主体地位（图3 F）。

图3 T3促进BAT和原代棕色脂肪细胞中的线粒体生物发生和线粒体周转

接着作者想探究T3对棕色脂肪线粒体自身存在何种影响(图4)，发现甲亢小鼠BAT中，长链和短链酰基肉碱的含量以及Cpt1b的表达显著增加（图4 A、B）。检测T3作用24h后检测OCR发现(图4 C)，原代棕色脂肪细胞基础耗氧率和最高耗氧率均显著增加，并且短时间内（30min），T3就能增强原代棕色脂肪细胞的线粒体呼吸(图4 C-F)。

图4 T3增加了BAT和原代棕色脂肪细胞中的脂肪酸氧化和线粒体呼吸

进而产生的一个问题是，既然T3能同时促进线粒体自噬和线粒体生成，那么线粒体自噬对维持线粒体正常功能又什么作用呢？

于是，作者在T3处理后，沉默自噬关键基因ATG5以及采用另一种自噬专一性抑制剂Bafilomycin A1（Baf）后发现，两种处理均能阻碍原代脂肪细胞基础和最高耗氧率的增加，并使得原代棕色脂肪细胞中羰基蛋白质含量增加。(图5 E)。线粒体是细胞中生产ATP，也是发生氧化磷酸化（OXPHOS）的主要场所，线粒体有氧呼吸过程中，会产生大量的氧自由基（ROS），ROS反应活性高，能迅速与细胞内各种生物大分子反应引起细胞水平上的损伤，其中包括 DNA、脂质和蛋白质的氧化损伤。蛋白质羰基化是蛋白质氧化损伤中的一种，其本身是氧化应激中的一种不可逆的化学修饰，指的是氨基酸残基侧链受到氧自由基攻击最后转变成羰基产物。并且T3处理后，棕色脂肪细胞中抗氧化酶mRNA表达水平无明显变化，只有当自噬被抑制后，抗氧化酶的表达水平才有所增加，这些发现表明，线粒体自噬在维持线粒体的质量控制中起重要作用，这种作用是通过阻止T3处理过的棕色脂肪细胞中ROS的积聚来实现的，进而说明线粒体自噬对于线粒体正常功能起重要作用。

图5 抑制自噬导致氧化应激增加，并降低原代棕色脂肪细胞的线粒体活性。

那么自噬对于甲亢小鼠机体产热的影响是什么呢？又是如何影响的呢？将甲亢小鼠BAT的Atg5特异性敲除后，发现与对照组相比，敲除组的体温相对降低(图6 B)，且BAT特异性敲除Atg5 的甲亢小鼠中羰基蛋白质和变形线粒体的含量增加(图6 C-D)。实验结果表明，T3诱导自噬，促进线粒体周转保护其免受氧化应激。

图6 特异性抑制BAT中的自噬可消除T3介导的产热作用。

作者随机进一步展开T3与自噬的机制研究，由于MTOR信号通路是一条经典的自噬相关通路，并且前人研究表明T3与MTOR信号通路有关，作者首先检测了甲亢小鼠BAT以及棕色脂肪细胞中MTOR相关蛋白的表达水平，结果发现，甲亢小鼠BAT和棕色脂肪细胞中磷酸化的MTOR 、EIF4EBP1、RPS6KB含量减少，且BAT中多种氨基酸的含量减少(图7)。

图7 T3抑制了BAT和原代脂肪细胞中的MTOR表达

文章最后发现甲亢小鼠BAT中，FOXO1乙酰化水平下降，其靶基因表达增加，表明T3处理激活脱乙酰基酶SIRT1，并最终证实SIRT1活性和自噬诱导对线粒体功能很重要。

图8 T3激活了BAT和原代脂肪细胞中的SIRT1