文献解读|Cell Rep Med（11.7）：肠道微生物 GABA 失衡成为轻度自闭症谱系障碍的代谢特征，与大肠杆菌过度表达有关

自闭症谱系障碍 (ASD) 的特征是社交互动受损、行为重复和兴趣刻板，对患者社会适应能力构成重大挑战。自闭症的全球患病率最近估计为 1%–2%，自闭症给社会带来了沉重的负担。人们普遍认为，早期干预对于取得积极成果至关重要，但由于自闭症症状多样，且言语和非言语交流表达能力有限，因此在幼儿中诊断自闭症仍然具有挑战性。迫切需要有效的实验室指标来阐明自闭症病因并跟踪其发展。

研究团队重点研究轻度 ASD病例，他们代表了该患者群体在全球范围内的主要人群。此外，本研究分为两个不同的阶段，以有效筛选和验证与 ASD 相关的核心微生物特征。其中，在筛选阶段，从专门的 ASD 研究所和邻近社区招募了一批 123 名儿童[56 名 ASD 和 67 名 正常发育 (TD)]（筛选队列）。此阶段的招募策略经过量身定制，以确保参与者的环境因素和人口分布的同质性。儿童自闭症评定量表评估证实，所有患有 ASD 的受试者确实都是轻度病例。为了扩大研究的地域多样性，他们组建了一个验证队列，包括来自多个机构的 40 名轻度 ASD 受试者，以及地理匹配的 TD 受试者。

为了研究 ASD 中肠道微生物群 (GM) 的代谢特征，他们首先确定了总共 32 种代谢物，包括 10 种神经递质、7 种短链脂肪酸 (SCFA)和 15 种胆汁酸 (BA)，根据文献或临床推断，它们广泛适用于 ASD 症状。他们首先使用了筛选队列中的第一次取样并进行了代谢组学分析（图 1 A）。为了最大限度地减少队列中混杂因素造成的分析偏差，他们应用了逆正态变换 (INT) 方法来实现根据年龄和性别调整的正态分布的代谢物水平。随后使用偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 进行分析，结果显示 ASD 和 TD 个体之间的代谢物谱有明显的分离（图 1 B），确定了 6 种差异代谢物：γ-氨基丁酸 (GABA)、去甲肾上腺素、二羟基苯丙氨酸、组氨酸、乙酸和甘醇石胆酸（图 1 C）。值得注意的是，这些差异代谢物中最显著的变化是 ASD 患者的 GABA 水平升高（图 1 D）。

为了更深入地探究 GABA 代谢的变化，他们分析了筛查队列中的第二轮样本，特别关注参与 GABA 代谢的代谢物（图 1 A）。他们选择了 10 种参与 GABA 合成和分解的代谢物，并应用 INT 方法对这些代谢物的水平进行标准化，并根据年龄和性别进行调整。PLS-DA 图显示两组之间的代谢物谱明显分离（图 1 E）。重要的是，与第一个样本的结果一致，与 TD 对照组相比，ASD 患者的 GABA 显著增加，而 Glu、谷氨酰胺 (Gln) 和富马酸显著下降（图 1 F）。这些结果表明 GABA 代谢存在复杂的、ASD 特异性波动。

为了验证在初步筛查中发现的 ASD 特异性代谢改变，并增强研究人群的地理多样性，他们建立了一个新的、地理上不同的队列，称为验证队列（图 2 A）。该队列的逻辑回归分析表明，性别和特定食物（如水果、蔬菜、深色蔬菜、真菌和藻类）的消费量成为与该队列的 ASD 诊断相关的重要混杂因素（图 2 B）。然后，他们进行了代谢组学分析，重点关注神经递质代谢物，共检测到 21 种代谢物，包括 GABA、Glu 和 Gln。为了控制地理、年龄、性别和饮食习惯等潜在混杂因素，他们应用了 INT 方法来标准化代谢物水平。PLS-DA 图显示 ASD 组和 TD 组之间存在不同的代谢组学特征（图 2C）。值得注意的是，ASD 组的 GABA 和 GABA/Glu 比率始终升高（图2D），证实了筛选阶段的结果。

此外，为了评估微生物 GABA/Glu 比率对 ASD 的临床诊断效用，他们进行了受试者工作特征分析。GABA/Glu 比率显示出强大的诊断潜力，曲线下面积为 0.759（图 2 E）。总之，这些结果表明微生物 GABA/Glu 比率是诊断 ASD 的可靠且独立的生物标志物。

为了找出 ASD 和 TD 患者之间 GM 组成的根本差异，以及微生物 GABA 代谢的变化，他们对筛查队列的粪便样本进行了 16S rRNA 基因测序（图 3 A）。利用细菌分类群的相对丰度，进行了 β 多样性和 α 多样性分析。基于 β 多样性分析的主坐标分析描绘了 ASD 组与 TD 组不同的 GM 谱（图 3 B）。然而，在 α 多样性分析中，Chao 指数（表明群落丰富度）和 Shannon 指数（表明群落多样性）均显示两组之间的水平相当（图 3 C）。

随后，为了识别与 ASD 相关的特定细菌属，他们利用了微生物组多变量关联线性模型 2 (MaAsLin2) 和线性判别分析效应大小 (LEfSe) 工具。调整年龄和性别后，MaAsLin2 揭示了 10 个属与 ASD 诊断现在相关（图 3 D）。独立于混杂因素运行的 LEfSe 确定了 ASD 组和 TD 组之间 26 个差异富集的属（图 S1 B）。值得注意的是，这两种方法一致确定了几个属，包括大肠杆菌/志贺氏菌、巨单胞菌、巨球菌、八叠球菌、Sarcina、魏斯氏菌和韦荣球菌，与 ASD 显著相关，这些发现与之前的报告一致，支持ASD患者存在明显的微生物群落改变。

接下来，他们研究了 GM 失调与 GABA 代谢失衡之间的潜在联系，使用 Pearson 相关性分析评估了上述 ASD 组和 TD 组之间的 7 个差异属。在调整年龄和性别后，确定了两个与 GABA/Glu 比率显著相关的属，包括大肠杆菌/志贺氏菌和巨球菌（图 3E）。有趣的是，在这些属中，大肠杆菌/志贺氏菌是唯一已知的能够在人体肠道中产生 GABA 的属，这意味着 GABA/Glu 比率升高可能与 ASD 患者中大肠杆菌或志贺氏菌的过度表达在生物学上有关。考虑到粪便样本的个体差异可能会掩盖ASD 患者真正的GM 菌群失调特征，他们假设 GABA/Glu 代谢失衡恶化可能会使这种菌群失调特征更加明显。令人惊讶的是，GABA/Glu 比率较高的 ASD 个体表现出最明显的 GM 菌群失调，大肠杆菌/志贺氏菌的丰度显著升高（图 3F）。总之，这些发现表明，微生物 GABA/Glu 代谢失衡与 ASD 中的 GM 菌群失调密切相关，尤其是大肠杆菌/志贺氏菌的过度表达。

为了阐明与 GABA 代谢失衡相关的 GM 菌群失调的分子机制，他们对粪便样本进行了宏基因组分析和相关的定量聚合酶链式反应 (qPCR) 验证（图 4 A）。他们从筛选队列中选择了 7 名 GABA/Glu 比率相对较高的 ASD 受试者（hASD，平均 GABA/Glu = 1.172 ± 0.523）和 8 名年龄和性别匹配的 TD 受试者（GABA/Glu 比率接近基线正常）（nTD，平均 GABA/Glu = −0.437 ± 0.697）。从这些参与者中采集了第三轮粪便样本，这些参与者均为男性，年龄在 3 至 5 岁之间（图 4 A）。

随后，他们比较了两组 GM 的结构和功能特征。细菌分类分析证实了明显的结构改变（图 4B），同时与神经正常的同龄人相比，hASD 儿童的 GM 丰富度和多样性均显著下降（图 4C）。令人惊讶的是，KEGG通路分析显示，与细胞代谢和体内平衡相关的多种分子通路丰度显著降低。具体来说，这些信号类别包括蛋白质加工、寿命调控、三羧酸 (TCA) 循环以及谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和组氨酸的代谢（图 4D）。能量和氨基酸代谢、蛋白质稳态、存活和生长的这些中断表明 hASD 中 GM 的生存能力受损。

鉴于 GM 处于动态环境中，具有各种细胞外应激源，如氧化应激，这些压力源会影响微生物活力和群落结构，他们比较了两组之间几种应激反应基因的丰度。这些分析显示，hASD组中gor、gpx、sod1和katG等基因的丰度显著增加。这些基因编码参与解毒超氧化物和过氧化氢的酶，这是在细胞外应激条件下触发的关键细胞内过程。应激反应基因表达的增加表明 GM 中氧化应激超载，可能反映了肠道环境受损。为了进一步研究这些应激相关变化与 GABA 代谢之间的联系，他们对 GABA/Glu 比率和应激反应基因丰度进行了 Pearson 相关性分析。值得注意的是，观察到应激反应基因与 GABA/Glu 比率之间存在显著的相关性，这表明异常的 GABA 代谢可能表明 GM 群落存在应激且功能失调。

在已鉴定的 ASD 相关途径中，谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸代谢类别包括一系列参与 GABA 代谢调节的酶编码基因，例如用于 GABA 降解的gabT（GABA 氨基转移酶）和gabD（琥珀酸半醛脱氢酶），以及分别用于合成谷氨酸和谷氨酰胺的gltD（谷氨酸合酶）和purF（酰胺磷酸核糖基转移酶）。为了进一步揭示 ASD 关联的 GM 中 GABA 代谢失衡的分子基础，他们分析了这些基因的丰度（图 4 E）。与 nTD 相比，hASD 中gabT和gabD显著增加，而gltD和purF显著下降。鉴于gabT和gabD的转录在微生物（如大肠杆菌和芽孢杆菌）中依赖于 GABA，这些结果表明，充足的微生物 GABA 供应可确保 ASD 患者 GM 群落中 GABA 的消耗。此外，参与谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸代谢相互作用的其他基因，包括aspB、argG、asdA和ala，在 hASD 中持续下降。此外，Pearson 相关性分析显示，在调整年龄和性别后，大多数上述基因与 GABA/Glu 比率显著相关（图 4 E）。这些分子水平的结果与代谢组学发现的 GABA/Glu 比率增加一致，证实了 ASD 患者的微生物 GABA 代谢受到了干扰。

为了更好地了解大肠杆菌在 GABA 代谢中的作用，他们将宏基因组学数据与毒力因子数据库进行了映射，该数据库包括已知的参与宿主肠上皮定植、微生物-宿主通讯和相互反应的细菌因子。他们确定了一组 21 种可用的大肠杆菌特异性粘附素进行分析，这些粘附素已知可促进细菌在肠上皮的定植。通过比较 hASD 组和 nTD 组之间这些粘附素的丰度，他们发现 7 种分子，例如 P 菌毛、S 菌毛和 F1C 菌毛，在 hASD 组中显著增加（图 4 E）。值得注意的是，在调整年龄和性别后，每种分子的丰度都与 GABA/Glu 比率显著相关（图 4 E），这意味着微生物 GABA/Glu 比率受大肠杆菌种群定植状态的影响。其余粘附素的丰度呈上升趋势，但统计学上并不显著。

为了建立潜在的大肠杆菌-GABA 轴，他们分析了大肠杆菌和志贺氏菌属的相对丰度，这两个属无法通过 16S rRNA 基因测序单独区分。hASD患者的大肠杆菌丰度始终高于 nTD 对照组，而志贺氏菌的相对丰度在这两组中仍然很低（图 4 F）。为了证实大肠杆菌可能有助于 GABA 的产生，他们通过 qPCR 检查了参与微生物 GABA 产生途径的关键酶，重点关注属特异性的谷氨酸脱羧酶 (GAD) 基因gadA和gadB。这两个基因在大肠杆菌中的丰度均显著增加（图 4 G）。综上所述，这些发现表明，大肠杆菌的过度表达可能通过gad基因导致 GABA 过量，从而导致 ASD 儿童的 GABA/Glu 比率升高。

为了阐明 GM 菌群失调（以大肠杆菌过度表达为特征）对宿主行为的影响，他们对雄性 C57BL6/J 小鼠进行了大肠杆菌攻击实验。为了研究大肠杆菌在体外产生 GABA 的能力，他们首先测试了一种商业无致病性大肠杆菌菌株从谷氨酸产生 GABA 的能力。他们对大肠杆菌菌株进行了基因改造，以敲除gadA、gadB或两个基因（图 5 A）。随后，他们使用 GABA 检测试剂盒测量了野生型和敲除菌株的 GABA 水平。结果显示，与野生型菌株相比，敲除菌株的 GABA 水平显著降低（图 5 B），证实了大肠杆菌依赖gad产生 GABA。

在随后的体内实验中，从出生后第21天至第25天（P21-P25）给模型灌胃野生型大肠杆菌，以模拟学龄前儿童大肠杆菌过度生长的情况（图5C）。经过7天的定植期后，粪便微生物组DNA的qPCR显示，大肠杆菌的丰度（图5D）和大肠杆菌特异性gad基因的丰度（图5E）在大肠杆菌攻击后显著增加。此外，三室测试（图 5 F）显示，大肠杆菌攻击组小鼠的社交偏好正常（图 5 G），但社交认知明显不足（图 5 H），表明大肠杆菌移植导致社交活动大幅减少，支持这一观点的后续社交互动测试（图 5 I）表明，大肠杆菌攻击组小鼠与陌生小鼠互动的时间显著减少（图 5 J）。

在旷场测试中（图 5 K），两组的梳理时间相当（图 5 L），表明大肠杆菌攻击组小鼠没有重复行为。比较在中心花费的时间（图 5 M）、行进距离（图 5 N）和平均速度（图 5 O），表明两组之间没有显著差异。这些研究结果表明大肠杆菌在调节社会行为方面具有特殊的作用，与焦虑、识别记忆异常或运动活动改变无关。

本文表明，遗传变异、年龄、性别和体重指数显著影响这种变异。本研究使用基于质谱的简化和高度定量的蛋白质组学工作流程，分析了 2147 名儿童和青少年的血浆，鉴定了 1216 种蛋白质。值得注意的是，其中 70% 的水平与上述至少一个因素有关，蛋白质水平也具有预测作用。QTL调控至少三分之一的蛋白质；从几个百分点到高达 30 倍，这表明遗传因素对血浆蛋白水平有显著影响，从儿童期一直持续到成年期。通过孟德尔随机化和共定位分析，本研究确定了 33 种心脏代谢特征的 41 个致病基因，强调了蛋白质 QTL 在药物靶标识别和疾病理解中的价值。