文献解读|Cell Death Dis（9.685）：肿瘤微环境研究热点：癌相关成纤维细胞促进卵巢癌进展

首先作者从上皮性卵巢癌（EOC）患者组织中分离原代CAFs 和 NOFs，两者形态均呈纺锤状并表达特异性标志物 α-SMA、FAP 和Vimentin（图1A）。Western-blot，RT-qPCR和免疫荧光实验表明，相比于NOFs，CAFs中的α-SMA和FAP的表达水平显著上调，Vimentin水平无差异（图1B，C）。

接着作者收集 CAFs和NOFs的条件培养基 (CAFs-CM，NOFs-CM) 共培养 EOC 细胞系 (SKOV3 和 A2780)。CCK8 实验结果表明相比于NOFs-CM ，CAFs-CM能明显促进EOC增殖（图1D）；侵袭实验结果表明，相比于NOFs-CM 或阴性对照 (NC) ，CAFs-CM 能明显促进SKOV3 和 A2780的侵袭（图1E，F）；划痕实验结果表明，CAFs-CM 能明显提高SKOV3 和 A2780 的迁移能力（图1G，H）。综上，表明CAFs可以促进的卵巢癌进展。

图1. CAFs促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭

作者为了探究是什么原因导致了CAFs 和 NOFs对卵巢癌的不同影响，收集了CAFs-CM和NOFs-CM进行LC/MS分析。实验共发现126个差异蛋白，其中95个蛋白在CAFs-CM中上调，31 个蛋白下调（图2A，B）。在众多上调的蛋白中作者将目光靶向于CRMP2（图2C），目前的研究表明CRMP2参与多种恶性肿瘤进展，因此作者猜想CRMP2可能是CAFs促进卵巢癌进展的关键因子。同时作者进行了验证，ELISA结果表明相比于NOFs-CM ，CAFs-CM中CRMP2含量较高（图2D）。Western-blot结果表明，相比于NOFs、SKOV3 和 A2780，CAFs 中CRMP2表达水平上调（图2E）。

图2. 液质联用鉴定CAFs-CM 和 NOFs-CM 差异蛋白质

作者为了验证CAFs外泌的CRMP2对卵巢癌细胞的影响，将SKOV3和 A2780 细胞分别与 CAFs-CM、NOFs-CM、CAF-CM + IgG 和 CAF-CM + CRMP2 中和抗体共培养。CCK8 实验表明，相比于与NOFs-CM，CAFs-CM共培养的卵巢癌细胞增殖能力更强， 但用CRMP2-Ab处理后显着抑制细胞增殖（图3A）。侵袭和迁移实验表明，相比于与NOFs-CM,与 CAFs-CM 共培养的 SKOV3 和 A2780 细胞都表现出更强的侵袭性和迁移能力，但用CRMP2-Ab处理后削弱了CAFs-CM的促转移作用（图3B-E）。同时，在细胞培养基中添加 r-CRMP2 能够显着增强卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力（图3F-J）。

图3. CAFs外泌的CRMP2促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭

为了探究CRMP2的下游作用机制，作者用 r-CRMP2处理A2780细胞，并进行RNA测序。结果显示，与对照组相比，r-CRMP2处理组共有 1045 个基因表达上调和 1500 个基因表达下调。KEGG通路富集显示，排名前三的通路为疱疹病毒感染、HIF-1信号和Hedgehog信号通路（图4A）。近年来的研究表明糖酵解通路受HIF-1α信号通路的调节，并参与多种恶性肿瘤进展。RNA测序结果也表明，糖酵解信号通路在通路富集中排名18，并包含16个基因富集在HIF-1信号的下游，包括HK2、PFKFB3、PDK1、PGK1和VEGFA（图4A）。

接着作者通过Western-blot和 RT-qPCR对上述结果进行验证，SKOV3和 A2780 分别用CAFs-CM和r-CRMP2进行处理，结果显示，卵巢癌细胞与CAFs-CM共培养 1 天至 3 天时，CRMP2、HIF-1α、糖酵解相关酶、GLUT3、P-Akt 和 P-S6k 的蛋白水平显著上调（图4B）。同时 r-CRMP2 以剂量依赖性方式诱导上述基因表达上调（图4C）。作者为了研究CRMP2的具体作用机制，分别在 A2780 细胞中过表达，SKOV3 细胞中敲低CRMP2。实验结果表明，敲除SKOV3 细胞中的 CRMP2 显着降低了 HIF-1α 及其下游糖酵解相关酶的蛋白水平，包括HK2、PGK1、PFKFB3、PKM2、PDK1和LDHA。同时，GLUT3和VEGFA的表达均下调。相反，过表达CRMP2上调了上述蛋白的表达（图4D，E）。同时作者检测了过表达和敲除CRMP2后卵巢癌细胞的细胞外酸化率 (ECAR)。结果表明敲除CRMP2后ECAR显著降低，但过表达组ECAR增加（图4F）。耗氧率（OCR）显示出与 ECAR 相反的趋势（图4G）。综上，表明CAFs外泌的CRMP2激活卵巢癌细胞HIF-1α-糖酵解信号通路。

图4. CAFs外泌的CRMP2激活卵巢癌细胞HIF-1α-糖酵解信号通路

接着作者使用BALB/c 裸鼠在体内建立异种移植和腹膜转移模型。SKOV3 分别与CAFs/NOFs 以 4:1 的比例混合进行皮下和腹腔注射。接种后第二天开始腹腔注射 IgG 和 CRMP2-Ab。实验结果表明SKOV3 与 CAFs 共注射组的肿瘤体积比NOFs 与SKOV3共注射组以及SKOV3单注射组大1-2 倍 (图5A, B )。有趣的是，注射CRMP2-Ab 明显抑制了肿瘤的生长（图5A，B，C）。腹膜内转移模型结果显示，SKOV3与CAFs共注射组的肿瘤重量最大，同时，CRMP2-Ab 给药组显着降低了肿瘤重量和转移灶的数量（图5D-F）。免疫组化（IHC）结果显示，CAFs 与 SKOV3 同时增殖，CRMP2-Ab 能有效减弱 CRMP2 和 HIF-1α 的表达（图5G）。上述结果表明CAFs外泌的CRMP2 在体内促进卵巢癌生长和转移。

结果5. CAFs外泌的CRMP2在体内促进卵巢癌生长和转移

接着，作者想去探究CRMP2与卵巢癌患者预后之间的关系。免疫组化结果显示，与正常组织相比，α-SMA 和CRMP2 在肿瘤组织中高表达（图6A）。组织芯片结果表明，α-SMA 和 CRMP2 在转移性病例中高表达（图6B）。CRMP2与肿瘤转移呈正相关，与生存率呈负相关（P  = 0.0083）（图6C，E）。同时采用Kaplan-Meier法进一步验证了 CRMP2 的表达与总生存期、无进展生存期和进展后生存期的相关性（图6D）。通过免疫荧光实验检测α-SMA 和 CRMP2 在肿瘤和癌旁组织中的共定位，结果表明它们仅在肿瘤基质组织中共表达，同时，正常组织中无法检测到共表达信号（图6F）。此外，作者将患者分为四组：CRMP2-/α-SMA-、CRMP2+/α-SMA-、CRMP2-/α-SMA+ 和 CRMP2+/α-SMA+， CRMP2+/α-SMA+与肿瘤转移和预后不良呈正相关（P  =0.0437）（图6G, H）。结果表明，肿瘤基质中 CAFs 的 CRMP2导致卵巢癌患者的不良预后。

图6. CRMP2导致卵巢癌患者的不良预后