文献解读|Molecules（4.927）：人参皂苷Rh3对HCT116结直肠癌细胞增殖抑制作用的转录组学研究

结直肠癌发病率占全球癌症总病例的10%，死亡率占癌症死亡总数的9.4%。目前，化疗仍然是治疗结直肠癌的主要手段，但是化疗有很多副作用，化疗药物很难在短时间内杀死大量的癌细胞，长期使用还会产生耐药性。因此，需要寻找一种低毒性的治疗方法。人参皂苷是人参中的主要活性成分，研究表明人参皂苷具有抗肿瘤功能，可以抑制结直肠癌细胞增殖。本研究使用RNA-Seq技术，分析了人参皂苷Rh3对HCT116结直肠癌细胞转录组的影响，阐述了人参皂苷Rh3抗结直肠癌的分子机制。

首先，检测Rh3对HCT116细胞和人正常结肠上皮细胞（HCoEpiC）的半抑制浓度（IC50），并以此计算选择指数来确定Rh3的安全范围。Rh 3对HCT116细胞的IC50为77.54 µg/mL，对人正常结肠上皮细胞（HCoEpiC）的IC50为235.8 µg/mL（图1A）。根据选择指数的计算公式：选择指数= HCoEpiC的IC50/ HCT116的IC50，计算出Rh3的选择指数为3.04，表明Rh3对癌细胞有效。同时，作者使用浓度为80 µg/mL的Rh3进行了后续实验。Transwell分析表明，相对于DMSO对照组，Rh 3处理抑制了细胞的迁移和侵袭（图1B，C）。流式细胞术分析表明，Rh3增加了凋亡细胞的比例（图1D）和G0/G1期细胞的百分比（图1 E）。这表明Rh3抑制HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞周期停滞在G0/G1期，并增加癌细胞凋亡。

图1 Rh3对HCT116细胞存活、迁移、侵袭和细胞周期的影响

聚类分析表明，Rh3组和对照组的基因表达模式不同，同一组样品的基因表达具有高度相似性（图2A）。和对照组相比，在Rh3组中筛选了685个差异表达基因（DEGs），其中314个下调，371个上调（图2B）。GSEA（基于GO和KEGG）显示DNA复制起始和DNA复制途径排在首位（图2C，D）。为了验证测序数据的准确性，使用RT-qPCR检测了10个DEGs的表达（图3），结果和测序数据一致。

为了验证Rh3作为抗结肠癌药物的潜力，作者从TCGA数据库下载了结肠癌患者基因表达和相关临床数据，重点关注与DNA复制相关的基因。和癌旁正常组织相比，这些基因在癌症组织中高表达（图2E中的蓝点）。然而，在Rh3处理后的HCT116细胞中，这些基因中的大多数表达出现下降（图2E中的红点）。

图2 Rh3对HCT116细胞转录组的影响

图3 RT-qPCR验证

（A）RNA-Seq；（B）RT-qPCR

流式细胞术检测结果表明，Rh3处理导致HCT116细胞停滞在G0/G1期。因此，作者使用WB检测了3个和DNA复制起始有关的蛋白（Orc6、Cdt1和Mcm2），结果显示：和对照组相比，这3个蛋白在Rh3组中的表达显著降低（图4A）。   

在真核细胞DNA复制起始阶段的G1期，复制起始复合体（ORC）结合在复制区域，其与Cdc6、Cdt1和微染色体维持蛋白2-7复合物（Mcm2-7）共同结合形成一个解旋酶装载中间体。免疫共沉淀结果表明，Rh3处理不影响中间体的形成（图4B）。Mcm2蛋白磷酸化是S期DNA合成的信号，WB结果表明Rh3处理不影响Mcm2的磷酸化（图4C）。这表明尽管Rh3下调Orc6、Cdt1和Mcm2蛋白表达，但不影响Mcm复合物在ORC复合物上的负载，也不影响Mcm2蛋白的磷酸化。

图4 Rh3对DNA复制起始蛋白表达的影响

Transwell分析结果表明，Rh3处理抑制了细胞的迁移和侵袭，作者分别检测了促进（N-Cadherin、Vimentin、MMP9和Lox）和抑制（ZO-1、β-Catenin和 E-Cadherin）迁移、侵袭的相关蛋白表达。结果表明：Rh3处理对Vimentin、MMP-9、β-Catenin和Lox的表达没有显著影响，但E-Cadherin和ZO-1表达显著增加，N-Cadherin表达显著下降（图5）。

图5 Rh3对细胞迁徙和侵袭相关蛋白表达的影响

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