EnglishFFPE转录组测序文库构建方法与优化策略（转录组测序建库步骤）
随着分子生物学技术的不断发展，转录组测序在研究基因表达和调控机制中扮演着越来越重要的角色。FFPE（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded）样本因其保存时间长、易于获取等优点，在临床病理诊断和研究中得到了广泛应用。FFPE样本的DNA质量较差，直接进行转录组测序会面临诸多挑战。本文将介绍FFPE转录组测序文库构建的方法与优化策略。
一、FFPE转录组测序文库构建方法
1. 样本处理
将FFPE样本进行解离，提取组织中的RNA。解离过程中，需要控制解离液的pH值、温度和时间，以确保RNA的完整性。
2. RNA纯化
提取的RNA通过RNeasy Mini Kit或Qiagen RNA Mini Kit进行纯化，去除蛋白质、DNA和其他杂质。
3. RNA降解物去除
纯化后的RNA可能含有降解物，需通过RNA降解物去除试剂盒进行进一步纯化。
4. RNA片段化
利用RNA酶进行RNA片段化，使RNA长度缩短至200-300 bp，便于后续文库构建。
5. 第一链合成
通过反转录酶将RNA转化为cDNA，并合成第一链cDNA。
6. 第二链合成与A尾添加
在第二链合成过程中，加入A碱基，为后续连接接头做准备。
7. 接头连接与PCR扩增
将接头连接到cDNA上，并通过PCR扩增获得足够的模板。
8. 纤维素酶消化
通过纤维素酶消化去除接头，得到合适的文库大小。
9. 标准化
通过PCR或片段化方法，使不同样本的文库大小趋于一致。
10. 测序
将构建好的文库进行高通量测序，如Illumina平台。
二、优化策略
1. 选择合适的RNA提取方法，提高FFPE样本的RNA质量。
2. 控制解离过程中的pH值、温度和时间，减少RNA降解。
3. 优化RNA纯化条件，去除杂质，提高RNA纯度。
4. 使用高纯度RNA降解物去除试剂盒，去除RNA降解物。
5. 优化RNA片段化条件，确保RNA片段化均匀。
6. 优化接头连接与PCR扩增条件，提高连接效率和扩增效率。
7. 选择合适的纤维素酶，确保文库大小合适。
8. 优化测序条件，提高测序质量和数据利用率。
通过以上方法与优化策略，可以构建高质量的FFPE转录组测序文库，为后续研究提供可靠的数据支持。
