文献解读|Protein Cell（21.1）：妊娠早期母体感染 SARS-CoV-2 后母胎界面的免疫再平衡

目前，由严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV-2) 引起的 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 大流行仍然对孕妇构成威胁。然而，人们对妊娠早期 SARS-CoV-2 感染对母胎界面的影响仍知之甚少。

本项研究总共招募了 34 名孕妇作为研究参与者。感染组患者于 2022 年 12 月感染 SARS-CoV-2，RT-PCR 检测出 SARS-CoV-2 阳性，感染时正处于妊娠第 1 至第 3 周。为了全面评估 SARS-CoV-2 感染对母胎界面发育的影响，研究者团队对 SARS-CoV-2 感染孕妇和对照组的胎盘组织（包括妊娠早期和妊娠中期）进行了单细胞转录组分析(scRNA-seq)（图 1A）。在绒毛膜中鉴定了 8 个细胞聚类（图 1B） 以及 6-8 周（妊娠早期）母体蜕膜组织中的七个细胞聚类（图1C）。根据先前描述的妊娠早期胎盘细胞标志基因的表达确定聚类注释（图 1D）。滋养细胞聚类包括绒毛细胞滋养细胞(VCT) (PARP1)、合体滋养细胞 (SCT)（CGB和ERVW-1）和绒毛外滋养细胞 (EVT)（DIO2和HLA-G）。他们还发现免疫细胞聚类主要由 T 细胞 (TC)、自然杀伤细胞 (NKC) 和巨噬细胞 (MAC) 组成。TC 高表达CCl5、 LTB和CD3D；NKC 表现出高表达XCL2、PRF1和GZMB；MAC 特异性表达STAB1和MS4A7。与各种组织的 HE 染色结果一致（图 1E），感染组和未感染组之间的细胞群体没有太大差异，表明 SARS-CoV-2 感染后缺乏可辨别的组织改变。

图1. 研究人群的特征和母胎界面的单细胞转录组谱。

(A)研究的实验设计。(B)按细胞类型着色的妊娠早期绒毛膜组织 UMAP 图。(C)按细胞类型着色的妊娠早期蜕膜组织 UMAP 图。(D)用于注释妊娠早期绒毛膜和蜕膜组织细胞的关键基因表达标记的气泡图。(E)妊娠早期蜕膜和绒毛膜组织的 HE 染色。

他们进行了差异表达分析，以研究SARS-CoV-2感染后妊娠早期组织中蜕膜免疫细胞和胎盘绒毛滋养层细胞的基因表达变化。 COVID-19组和对照组之间的基因表达水平有显著差异（图2A-B）。此外，基于差异表达基因(DEG)的GO分析显示，免疫细胞亚群（包括MAC、NKC和TC）以及滋养层细胞亚群（包括EVT、SCT和VCT）中上调的基因均参与抗病毒反应，这表明在妊娠前期，母胎界面发生了广泛的抗病毒反应（图2B）。干扰素诱导的跨膜蛋白 (IFITM) 家族成员负责检测病毒和防御感染。与对照组相比，COVID-19 组EVT 中的IFITM2和IFITM3、SCT 和 VCT 中的IFITM3 、MAC 和IFNG中的IFNGR1和IFI44L、TC 中的IFITM2和IFITM3水平均显著上调（图 2C），表明 SARS-CoV-2 感染后，母胎界面发生了广泛的抗病毒反应。此外，细胞间通讯分析显示，COVID-19 组免疫细胞亚群和滋养层细胞亚群之间的相互作用强度和相互作用数量降低（图 2D）。免疫细胞的传入相互作用强度的下降比传出相互作用强度的下降更为明显，这一观察结果表明SARS-CoV-2感染对滋养层细胞免疫细胞行为的调节有影响。

综上所述，与未感染的孕妇相比，感染SARS-CoV-2的孕妇表现出母胎界面免疫的异常激活和广谱的抗病毒反应，母胎界面细胞间的通讯也受到影响。

图2. SARS-CoV-2 在母胎界面诱导广泛的抗病毒反应。

(A) 火山图显示感染 SARS-CoV-2 的孕妇蜕膜组织免疫细胞中的 DEG。 (B) 感染 SARS-CoV-2 的孕妇蜕膜组织免疫细胞中上调和下调的 DEG 的GO富集分析。 (C) 妊娠早期对照组和 COVID-19 组不同细胞类型中选定 DEG 的小提琴图。 (D) 免疫细胞和滋养层细胞之间的差异相互作用强度。在 COVID-19 组中，所有特定细胞之间的相互作用强度均降低。

研究表明，在人类胎盘早期发育过程中，母体免疫系统会发生多种变化，阻止母体免疫细胞（特别是 NKC 和 MAC）攻击胎盘中的胎儿来源的半同种异体细胞。为了进一步评估特定的免疫细胞群及其对SARS-CoV-2感染的反应，他们将免疫细胞（CD45+）分为亚群，并进行降维和细胞类型识别（图3A-C）。II型干扰素（IFN-γ）主要由免疫细胞产生，在针对病毒、某些细菌和原生动物感染的先天性和适应性免疫中起重要作用，并能通过激活巨噬细胞抑制SARS-CoV-2复制。与对照组相比，COVID-19组TC中IFNG的表达和MAC中IFNGR（IFN-γ受体）的表达上调（图2C）。此外，细胞间通讯分析显示，NKC 和 MAC 之间的 IFNG-IFNGR 信号传导和其他巨噬细胞活化因子，如 CSF1（克隆刺激因子 1）-CSF1R（克隆刺激因子 1 受体）得到增强（图 3D），表明母胎界面的免疫细胞发生激活。

相反，巨噬细胞相关细胞 (MAC) 的比例保持不变，如蜕膜组织的免疫荧光染色所示（图 3E-F）。在 COVID-19 组中，预计在 MAC 激活后主要组织相容性复合体 II 类分子（包括 HLA-DRA、HLA-DRB5、HLA-DPA1 和 HLA-DQB1）的表达水平会降低（图 3G）。此外，与 MAC 相关的差异表达基因呈现下调模式，并在免疫反应通路中显著富集（图 2B）。这些发现表明在妊娠早期感染 SARS-CoV-2 数周后，母胎界面的抗病毒反应有限。

图3. SARS-CoV-2 导致免疫细胞激活受限。

(A) UMAP 图显示妊娠早期蜕膜组织细胞中 CD45 的表达水平。(B) 妊娠早期蜕膜组织中 CD45+细胞的 UMAP 图。(C) 用于注释妊娠早期蜕膜组织免疫细胞的关键基因表达标记的气泡图。(D) 气泡图显示妊娠早期对照组和 COVID-19 组 NKC 和 MAC 之间的配体-受体相互作用。(E) 堆积条形图显示妊娠早期对照组和 COVID-19 组之间不同免疫细胞类型的百分比。(F) 蜕膜中 CD45 和 CD14（MAC 标记）的免疫荧光染色（左图）以及显示妊娠早期对照组和 COVID-19 组之间 MAC 百分比的条形图。(G) 妊娠早期对照组和 COVID-19 组 MAC 中选定 DEG 的小提琴图。

母胎免疫耐受现象是母胎界面上免疫激活与抑制的多系统、多因素的平衡过程，其中最重要的是对胎儿滋养细胞HLA I类分子（HLA-G/HLA-E/HLA-F）表达和蜕膜NK细胞活性的调节。NKC通过其表面受体识别HLA抗原，传递抑制信号，调控NKC细胞毒活性和细胞因子释放。

HLA-G 在维持母胎界面的免疫耐受和保护绒毛外滋养细胞 (EVT) 在侵入母体组织期间免受母体免疫细胞攻击方面起着至关重要的作用。免疫组织化学分析证实，SARS-CoV-2 感染上调了 EVT、合体滋养细胞 (SCT) 和绒毛滋养细胞 (VCT) 中的 HLA-G 表达（图 4A-B）。此外，通过细胞间通讯分析观察到自然杀伤细胞 (NKC) 与 EVT 通过 COL6A1-(ITGA1 + ITGB1) 之间的相互作用增强，表明 EVT 具有主动侵袭和迁移能力（图 4C）。 RNA 速度分析表明，在妊娠前三个月，从 VCT 到 EVT 和 SCT 的双向分化轨迹不受 SARS-CoV-2 感染的影响（图 4D）。

生理性缺氧条件下 ATP 生成减少可抑制胎盘炎症反应。他们观察到 CD39 (ENTPD1) 和 CD73 (NT5E) 显著上调，这已通过免疫组织化学实验得到证实（图4E），这两种蛋白都能水解 ATP，表明炎症反应可能不会表现出长时间的持续性，这可能是由于早期母胎界面的免疫抑制环境和胎盘绒毛细胞的免疫耐受性所致。

HLA-G 水平升高可以抑制免疫球蛋白的产生并防止过度的细胞因子分泌。在本研究中，他们观察到 COVID-19 组细胞中没有出现细胞因子风暴现象。此外，免疫细胞表现出与细胞因子风暴相关的基因组的细胞因子评分降低（图 4F）。

综上所述，SARS-CoV-2感染后母胎界面滋养细胞的免疫耐受性增强，保证了母胎界面的稳定性。滋养细胞免疫耐受性的提高可能对预防过度免疫诱发的细胞因子风暴和母胎界面损伤至关重要。

图4. 滋养层细胞的免疫耐受性增强。

(A)孕早期对照组和 COVID-19 组滋养层细胞中 HLA-G 的小提琴图。(B)孕早期对照组和 COVID-19 组绒毛膜组织中 HLA-G 的免疫组织化学和免疫组织化学评分。(C)气泡图显示孕早期对照组和 COVID-19 组的 NKC 和 EVT 之间的配体-受体相互作用。(D)RNA 速度流线嵌入孕早期绒毛膜组织的 SCT、EVT 和 VCT 的 UMAP 图上。(E)孕早期对照组和 COVID-19 组 SCT 中选定 DEG 的小提琴图。(F)箱线图显示对照组和 COVID-19 组之间不同细胞类型的细胞因子评分。

滋养层细胞感染单纯疱疹病毒 (HSV) 或巨细胞病毒 (CMV) 会导致细胞凋亡和细胞侵袭性降低。HPV 感染与胎盘发育异常或流产有关。为了研究 SARS-CoV-2 感染对母胎界面的潜在持续影响，他们对流产事件期间妊娠 12-16 周（中期妊娠）的胎盘组织进行了scRNA-seq。这些孕妇感染SARS-CoV-2的时间与上述时期相吻合，他们鉴定了十种不同的细胞类型，包括滋养层细胞和免疫细胞（图5A），同时评估了用于细胞识别的标志物的表达水平（图5B）。EVT 侵袭和迁移至母体区域是保证胎盘正常发育的关键。对妊娠早期至妊娠中期 EVT 的 RNA 速度分析显示，其分化轨迹正常（图 5C）。孕中期新冠肺炎组与孕中期对照组HLA-G表达无差异（经免疫组化验证，孕中期COVID-19组绒毛膜激素合成基因CGB3等及EVT侵袭分化相关基因IGFBP3、 EGFR等表达水平与孕中期对照组也一致（图5D）。在妊娠早期组中发现的大多数DEG在妊娠中期胎盘发育组中也变得不显著（图5E）。

他们发现母体感染 SARS-CoV-2 引起的母胎界面免疫变化不会影响细胞侵袭。没有证据表明母胎界面的短期免疫反应会影响胎盘结构。在妊娠早期 COVID-19 组细胞中观察到的显著转录组异常随着妊娠中期胎盘组织的发育而减轻，表明 SARS-CoV-2 的影响逐渐减弱。

SARS-CoV-2 对母胎界面的影响随着发育逐渐减小。

(A)按细胞类型着色的中期妊娠胎盘组织 UMAP 图。(B)用于注释中期妊娠胎盘组织细胞的关键基因表达标记的气泡图。(C)嵌入在来自孕早期绒毛膜组织和孕中期胎盘组织的 SCT、EVT 和 VCT 的 UMAP 图上的 RNA 速度流线。(D)孕中期对照组和 COVID-19 组胎盘组织中 HLA-G 的免疫组织化学和免疫组织化学评分。(E)桑基图显示孕早期和孕中期组织之间 EVT 的 DEG 变化。

SARS-CoV-2 还会影响细胞代谢的调节，为了研究这一点，他们收集了妊娠早期蜕膜和绒毛膜组织以及妊娠中期胎盘样本，以进行非靶向代谢组学分析（图 6A，图S6A）。为了研究正常组和 COVID-19 组代谢物调控的差异，他们分别对正离子和负离子模式下富集的代谢物进行了差异丰度代谢物分析（图S6B）。结果显示，与妊娠早期的蜕膜和绒毛膜组织相比，妊娠中期胎盘组织中差异调节代谢物的数量显著减少（图6B）。这一发现表明，随着妊娠的进展，SARS-CoV-2对母胎界面组织的影响呈下降趋势，这与转录组数据一致。

此外，他们对不同组织组所有富集的代谢物进行了主成分分析（图 6C），发现相对于早期组织，正常组和 COVID-19 组的中期妊娠胎盘组织表现出更大的相似性而更小的差异性，为上述观察结果提供了进一步的支持。此外，对差异富集代谢物的 KEGG 分析显示，SARS-CoV-2 对母胎界面细胞的影响主要集中在氨基酸代谢和磷脂代谢，这与以前的研究一致（图6D）。值得注意的是，感染后数周 COVID-19 组的精氨酸水平升高，这可能表明对 SARS-CoV-2 感染的精氨酸积累反应（图 6E）。此外，与对照组相比，COVID-19 组的精氨酸通路前体代谢物和相关基因表达呈下降趋势（图 6E-F）。在妊娠中期，胎盘组织中的精氨酸水平和相关基因表达没有显著差异。除了精氨酸外，在妊娠早期绒毛膜组织中还检测到了一些磷脂水平及其相应酶的变化；然而，这些差异在妊娠中期胎盘组织中变得不显著（图S6C-D）。虽然 COVID-19 在感染后 5 周对精氨酸代谢和磷脂代谢产生了丰富的影响，但这些影响在大约 10 周后减弱。

图6. SARS-CoV-2 感染引起的代谢变化在胎盘发育过程中逐渐减弱。

(A)非靶向代谢组学分析的实验设计。(B)堆叠条形图显示每组中差异调节代谢物的数量。(C)三种组织样本的 PCA 图。(D)三种组织差异调节代谢物的 KEGG 分析。(E)妊娠早期绒毛膜组织和妊娠中期胎盘组织中对照组和 COVID-19 组的精氨酸生物合成图和一些代谢物的标准化水平。(F)妊娠早期绒毛膜组织和妊娠中期胎盘组织中对照组和 COVID-19 组的精氨酸生物合成相关基因的小提琴图。

图S6. SARS-CoV-2感染引起的代谢改变在胎盘发育过程中逐渐减弱。

(A)饼图显示了每一类中注释的代谢物的比例。(B)使用正离子和负离子模式显示在不同组织中富集的上调和下调代谢物的火山图。(C) CTRL组和COVID-19组中孕早期绒毛膜组织和孕中期胎盘组织中各类磷脂的标准化水平。(D) CTRL组和COVID-19组中孕早期绒毛膜组织和孕中期胎盘组织中磷脂生物合成相关基因的小提琴图。

本项研究对妊娠早期感染 SARS-CoV-2 的胎盘样本的单细胞转录组学和代谢组学进行了全面分析。与对照胎盘相比，SARS-CoV-2 感染在感染后的最初几周内引发了母胎界面的免疫反应，并诱导了氨基酸和磷脂谱的代谢改变。然而，随后的免疫细胞激活和滋养层细胞免疫耐受性的增强建立了一种新的动态平衡，减轻了对母胎界面的影响。值得注意的是，母胎界面的免疫反应和代谢改变在妊娠中期逐渐下降。本项研究强调了母体感染 SARS-CoV-2 后的前两个孕期期间的适应性免疫耐受机制和免疫平衡的建立。

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