文献解读|Food Res Int（7.425）：比较转录组和蛋白组分析揭示低温对大蒜绿变的调控机制

将大蒜分别保存在4℃和30℃条件下，发现4℃保存大蒜呈绿色，而30℃保存大蒜呈白色（图1A）。紫外光谱分析结果表明，30℃保存的大蒜紫外可见光谱平滑，无吸收峰。而4℃保存的大蒜在440 nm和590 nm处出现两个吸收峰，它们分别代表黄色素和蓝色素的最大吸收峰（图1B）。

图1 4℃和30℃保存条件下大蒜的颜色变化

转录组测序结果显示，一共从6个样本中获得309828070个Raw reads，并从中筛选出303017124个Clean reads，6个样本的Q20和Q30的平均值分别为98.51%和95.37%，GC含量均大于43%（表1），这表明测序数据质量高，可用于后续分析。进一步对测序数据组装，发现长度在0到500 bp之间的转录本数量最多，约占52%，而只有624个转录本的长度在4001到4500 bp之间（图2A）。此外，蛋白质组测序结果显示，在6个样本中共鉴定了29987个肽，15163个蛋白质和5232个蛋白groups（图2B）。

表1 转录组测序质量评估

图2 转录本序列长度分布和蛋白谱信息

作者对6个大蒜样品的差异进行主成分分析（PCA），基于基因和蛋白表达的PCA样本分布图如图3A和图3B所示。4℃和30℃保存的大蒜样品明显分为两个不同的集群，这表明在不同温度下保存的大蒜在基因和蛋白质水平上都有显著的差异。

图3 大蒜样品的基因（A）和蛋白质表达（B）PCA分析

与30℃保存的大蒜相比，在4℃保存的大蒜中分别鉴定到14381个DEGs和861个DEPs，其中268个因子在基因和蛋白质水平上都有显著变化（图4A）。在268个因子中，有186个基因上调，82个基因下调；在蛋白质水平上，有144个蛋白上调和124个蛋白下调（图4B）。此外，Venn分析显示，208个因子的表达趋势在基因和蛋白水平上是一致的，包括135个上调和73个下调。

图4 大蒜样品中总的DEGs、DEPs（A）和共享因子（B）的联合Venn分析

为探究低温调控大蒜变绿的分子机制，作者对DEGs、DEPs进行了GO分析。在生物过程（BP）中，DEGs/DEPs主要涉及的类目为代谢过程、细胞过程和单有机体过程等；在细胞组分（CC）方面，DEGs/DEPs主要富集类目为细胞、细胞部分和膜；在分子功能（MF）方面，DEGs/DEPs主要富集类目为催化活性和结合。这表明，细胞代谢及物质和能量的产生、交换，在低温调节大蒜变绿过程中发挥重要作用，可以从新陈代谢的角度探讨低温探究大蒜变绿的机制。

图5 DEGs或DEPs前20个GO条目

双组学联合的KEGG富集分析表明，亚油酸代谢、谷胱甘肽代谢和叶酸碳库3个通路在基因和蛋白水平上共同富集（图6A）。DEGs显著富集到MAPK信号通路、半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解通路和光合生物的碳固定通路，这些通路主要与信号转导、氨基酸代谢和能量代谢有关。DEPs显著富集的通路可分为三类：一是内质网中的剪接体和蛋白质加工；二是内吞作用；三是角质/黄嘌呤/蜡的生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、抗坏血酸和醛酸盐代谢。这表明，谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢和能量代谢在低温调节大蒜变绿中发挥重要作用。

此外，在谷胱甘肽代谢中有28个下调DEGs和14个下调差异蛋白；在氨基酸代谢中有50个上调DEGs，22个下调DEGs；在光合生物的碳固定（能量代谢）和MAPK信号通路中，分别有30个和21个上调DEGs，6个和37个下调DEGs（图6B）。

图6 DEGs和DEPs联合KEGG分析

为探究低温调节大蒜变绿的具体分子机制，作者从参与谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、亚油酸代谢和叶酸碳库等通路的因子中，筛选出基因和蛋白表达趋势一致的因子（表2）。研究表明，谷胱甘肽还原酶（GR）可以催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）转变为还原型谷胱甘肽（GSH），而谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）发挥相反的作用。与30℃保存的大蒜相比，4℃保存的大蒜中GR的表达下降，而GPX的表达增加（表2），这可能诱导大蒜组织中的GSSG增加，以抑制自由基的产生，避免质膜过氧化，以应对低温胁迫。

谷胱甘肽转移酶（GST）可以催化亲电性外源物质与GSH结合，5个基因诱导了GST的表达增加（表2），这可能导致低温保存大蒜中GSH含量下降，这与GSR表达下降和GPX表达增加的结果一致。同样，pepA和pepN的表达增加，这导致三肽谷胱甘肽降解为单一氨基酸，可能与大蒜中蓝绿色素的前体物质GSAC和GSPC的合成有关。

除物质代谢外，4℃保存大蒜中蓝绿色素的产生还依赖于能量供应。葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶（G6PDH）和异柠檬酸脱氢酶（ICDH）在催化生成α-酮戊二酸的同时，还伴随着NADP+到NADPH的转化以及ATP的产生。从表2中可知，与30℃保存大蒜相比，4℃保存大蒜中IDH1和G6PD的表达量上升，这为4℃保存大蒜的谷胱甘肽代谢和色素的合成提供了还原力NADPH和ATP。

氨基酸对蓝绿色素的生物合成也至关重要，氨基酸代谢在低温调控大蒜变绿中发挥了重要作用。如表2所示，所有参与半胱氨酸和蛋氨酸代谢的关键因子（speE、cysK、metC、metE、TAT、GOT1、MDH1、MDH2、mmuM、metK和ahcY）在基因和蛋白水平上都显著上调，表明大蒜中半胱氨酸和蛋氨酸的生物合成和代谢在低温保存条件下得到增强，为大蒜的色素产生提供物质基础。

表2  30℃和4℃保存大蒜中DEGs和DEPs表达情况

作者检测了与低温调节大蒜变绿有关的关键因子的表达水平和关键代谢物的含量，对谷胱甘肽代谢相关基因的RT-qPCR分析表明，与30℃保存大蒜相比，4℃保存大蒜中IDH1、pepA、G6PD、GST和GGT的表达上调，而GSR和PGD表达下调（图7A），这与RNA-seq数据一致。4℃保存的大蒜中，ATP含量显著高于30℃保存的大蒜，说明低温贮藏通过TCA循环和HMS途径为大蒜发绿提供了能量（图7B）。总的来说，4℃保存大蒜的氨基酸含量高于30℃保存大蒜，尤其是丙氨酸、精氨酸和天冬氨酸（图7C），说明低温贮藏可以促进大蒜中氨基酸的积累，为大蒜的绿变提供充足物质基础。丙烯基半胱氨酸亚砜（1-PeCSO）是大蒜变绿过程中主要的色素前体物质，可由原花青素（GSPC）转化。在4℃的大蒜中，GSPC较少，而1-PeCSO较多（图7D），这解释了4℃保存下大蒜变绿的现象。

图7 谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢、能量代谢和色素前体在不同温度保存大蒜中的验证

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