文献解读|Cell（45.1）：空间邻位测序绘制了生发中心的发育动态图谱

对组织中关键分子进行空间分辨测量，为理解生物学诸多领域的基础表型和疾病表型铺平了道路，并可能促进组织结构和功能计算模型的开发和训练。空间转录组学已成为高通量技术中的热门选择，因为它能够利用现有的基因组学方法轻松获取转录本，并以高分辨率绘制组织切片中的基因表达图谱，揭示新的细胞身份。然而，仅凭转录组数据无法捕捉到调控细胞和组织的诸多复杂表型和信号事件。蛋白质是许多细胞功能的基本执行者，例如抗原识别、共刺激、细胞活化、细胞通讯和效应功能。除了蛋白质表达之外，要了解细胞如何在组织内协调运作，还需要在蛋白质的天然空间环境中直接测量蛋白质-蛋白质相互作用。蛋白质形成动态复合物，介导细胞内信号传导（顺式相互作用）和细胞间通讯（反式相互作用）。这些相互作用网络调控免疫激活、组织稳态和疾病进展，但在完整组织中，它们仍未得到充分研究。因此，整合转录组学、蛋白质组学和相互作用组学（蛋白质相互作用）数据并提高空间分辨率，对于全面表征细胞状态、研究功能性组织区室、预测信号传导动态以及理解完整组织中的细胞功能至关重要。

研究团队开发了空间邻位测序（Sprox-seq）技术，这是一个可扩展的实验和计算平台，能够同时对完整组织切片中的蛋白质丰度、蛋白质相互作用和RNA表达进行原位分析。Sprox-seq将条形码邻近连接分析与空间转录组学相结合（图1A）。他们首先开发并验证了一系列适用于完整人体组织邻近连接分析的抗体-寡核苷酸偶联物（AOC），并利用现有的空间转录组学流程实现了多重读出。他们优化了多个实验条件，包括组织固定和透化、AOC染色以及减少非特异性结合。他们还开发了统计/计算方法来去除邻近连接分析中常见的背景噪声，从而实现了蛋白质复合物的定量分析。他们将基因表达测量与蛋白质组学读出相结合。因此，Sprox-seq能够同时对完整的二维组织切片中的大量表面蛋白、蛋白复合物和mRNA进行原位分析，在保持组织天然结构的同时，支持高通量分子检测。Sprox-seq检测的蛋白二聚体数量与靶蛋白数量呈二次方关系，这极大地提高了其在组织高通量分析中的多重分析能力。

他们将Sprox-seq技术应用于人扁桃体组织，扁桃体是一种重要的次级淋巴器官，负责抵抗病原体感染。扁桃体组织结构复杂，包含多个结构不同的空间区域，包括初级滤泡、套区、生发中心、T细胞/B细胞（T:B）交界区和上皮区。免疫系统的各种细胞，例如B细胞、T细胞和滤泡树突状细胞（FDC），在扁桃体组织中以时空动态的方式相互作用。生发中心(GC)作为扁桃体组织的关键功能结构，由亮区和暗区组成，是抗原激活的B细胞进行体细胞高频突变和阳性选择以产生高亲和力抗体的场所。这一过程受到不同细胞类型之间动态相互作用的严格调控。扁桃体组织是展示Sprox-seq 实用性的理想测试案例，因为它具有高度区室化和多细胞特性，并且依赖于跨多个空间和时间尺度的蛋白质相互作用和细胞间相互作用（图1B-C）。

对样本 A1 进行基于 RNA 表达的无监督聚类分析，结果揭示了九个主要的空间组织聚类，这些组织聚类根据 H&E 染色和典型标记物表达进行注释，分别为上皮、结缔组织、亮区、暗区、非GC滤泡、T 细胞区和 T/B 交界处（图 1D-E）。邻近连接分析 (PLA)数据和蛋白质数据采用中心对数比 (CLR) 方法进行标准化，该方法与 Seurat中使用的方法相同。基于标准化蛋白质丰度的聚类分析与基于 RNA 的聚类分析结果高度相似，证实抗体组合能够捕获扁桃体组织中的主要细胞群（图 1F）。此外，基于标准化 PLA 数据（包含空间邻近信息）的聚类分析也重现了类似的组织结构（图 1G）。在样本 B1 和 D1 中观察到了类似的结果。

为了验证 Sprox-seq 是否能准确捕获蛋白质表达模式，他们使用探针 A 和探针 B 的组合，对相邻组织切片进行了典型标记物的免疫荧光染色。关键标记物的空间表达谱，包括 B 细胞相关标记物（CD21 和 CD35）、免疫球蛋白同型（IgD 和 IgG）以及 T 细胞特异性标记物（CD3 和 CD4），在免疫荧光染色和 Sprox-seq 检测结果之间高度一致（图 2A）。此外，Sprox-seq 捕获的所有其他蛋白质的表达模式也显示出与免疫荧光染色结果一致的预期空间分布。值得注意的是，小鼠同型对照（mIgG1、mIgG2a 和 mIgG2b）的信号较低，表明背景结合可忽略不计。综上所述，这些结果表明，PLA 衍生的蛋白质数据能够可靠地反映蛋白质在组织环境中的丰度和空间定位。

接下来，他们分析了蛋白质共表达模式，并计算了三个样本间平均成对相关性（图2B）。结果观察到四个不同的模块。蛋白质CD21、IgM、CD23、IgG、CD35和VCAM1聚集在一起。PD1、PDL2和CD86等共信号分子之间也观察到了较强的相关性。T细胞标志物CD3、CD4、CD8和CD27形成了一个相关模块，另一个模块则由CD147、CD38、CD29、CD81、CD20和CD32组成。相比之下，对相同基因的RNA表达进行类似的关联分析则显示出弱得多的模式（图2C），这进一步证明了测量蛋白质信号的重要性。

在样本 A1 中，他们比较了不同空间聚类的蛋白质表达，并基于 RNA 数据进行了注释（图 2D）。T 细胞模块（包括 CD3、CD4 和 CD27）主要定位于 T 细胞区。在 T/B 细胞交界处观察到 T 细胞标志物 CD3、CD4 和 PD1 以及幼稚 B 细胞标志物 CD19、CD20 和 IgD 的中等表达，表明该区域存在 T 细胞和 B 细胞共存。IgD、CD19、CD20、CD21、CD23、CD24 和 CD40 在非生发中心滤泡中表达，这与该区域存在成熟幼稚 B 细胞状态相符。CD9、CD147 和 ICAM1 在上皮中富集，而 CD29 和 CD81 在结缔组织中观察到。亮区和暗区的表达谱相似，但表达水平存在差异。在样本 B1 和 D1 中观察到类似的空间表达模式，尤其是在 B1 中。样本 D1 在上皮区域显示出一些变化，并且缺乏非 GC 滤泡，表明扁桃体样本之间存在不同的生理状态。

为了更精确地比较亮区和暗区之间的蛋白质表达谱，对所有三个样本的数据进行了联合分析。通过典型基因标记（亮区为 CD83、LMO2 和 BCL2A1；暗区为 CXCR4、AICDA、MME 和 FOXP1）的表达以及亮区中 FDC 标记（FDCSP、CLU、CR2 和 CXCL13）和 T 滤泡辅助细胞 (Tfh) 标记（PASK、TIGIT 和 IFITM1）的富集，证实了暗区和亮区的聚类和注释。蛋白质表达分析显示，IgM、CD21、CD35、IgG、CD23、PD1、CD40、CD86、ICAM1 和 VCAM1 等蛋白在亮区显著富集（图 2E），这与其作为 B 细胞-滤泡树突状细胞 (FDC) 相互作用和 B 细胞成熟区域的既定功能相符。相比之下，其他一些蛋白在暗区表达更高（图 2E）。

为了系统地从原始PLA计数数据中鉴定出显著的蛋白质复合物（图3A），他们应用了Fisher精确检验，并将检验中校正后的p值低于0.05的共结合事件视为显著事件。每个蛋白质复合物的空间分布进一步概括为阳性斑点的比例，即检测到该复合物具有统计学意义的组织斑点所占的比例。

全组织水平分析揭示了多种经典蛋白复合物，这些复合物已知存在于人扁桃体中（图3B）。许多同源二聚体均以高阳性斑点比例持续检测到。经典异源二聚体，包括CD19-CD21、CD21-CD35、CD81-CD9和CD29-ITGA4鉴定出来，且均表现出高阳性斑点比例，表明其相互作用高度稳定。此外，还鉴定出几种非经典相互作用，包括CD32-CD38、CD147-CD38和CD20-CD32，提示它们在膜微区中相互作用。大多数涉及小鼠同型对照的PLA配对未能通过统计检验，进一步支持了该分析框架的特异性（图3B）。在扁桃体组织中发现这些典型的蛋白质复合物，证明了该技术在识别蛋白质复合物方面的灵敏度。

随后计算每对蛋白质的重叠分数，以分析其相互作用强度。基于蛋白质重叠分数的聚类分析重现了与转录组数据一致的空间组织模式，表明蛋白质相互作用强度也能反映组织结构（图3C）。在通过Fisher精确检验的蛋白质对中，阳性斑点比例较高的蛋白质对也表现出更高的重叠分数，表明空间分布与相互作用强度呈正相关（图3D）。

为了探究整体相互作用格局，他们构建了在空间聚类中检测到的蛋白质复合物的蛋白质相互作用网络。基于对空间普遍性的系统评估以及与阴性对照的基准比较，他们保留了阳性斑点比率大于0.15的蛋白质复合物用于网络构建。在这些网络中，节点代表蛋白质，边的粗细表示聚类内蛋白质的平均重叠分数，节点颜色反映了相关的细胞类型或功能类别。聚类特征的相互作用网络揭示了区域特异性的相互作用模式（图3E）。富含B细胞的区域，包括非GC滤泡、暗区、亮区和套区，与上皮区域和T细胞区域相比，表现出更高的相互作用复杂性，这反映了抗体组的设计。

在富含B细胞的区域中，非GC滤泡的相互作用水平最低，其次是暗区和套区，而亮区则表现出特别丰富的细胞间连接模式，其特征在于来自不同免疫细胞类型和不同功能类别的蛋白质之间的相互作用。这种模式表明，在这些区域内，相互作用网络复杂性与B细胞功能状态呈正相关。亮区观察到的较高网络复杂性可能反映了其通过与其他细胞类型的动态通讯来介导B细胞选择的作用。相比之下，暗区的网络整合度较低，表明其微环境的相互作用较弱（图3E）。在生物学重复样本中观察到一些相互作用网络的差异（图3E），揭示了由组织状态异质性导致的相互作用谱的动态变化。值得注意的是，在所有三个样本中，富含B细胞的区域内网络复杂性与B细胞功能状态之间的正相关性均得到一致观察到。

为了研究B细胞状态转变过程中蛋白质相互作用的动态变化，他们对来自三个样本的B细胞富集聚类进行了联合分析。代表更幼稚B细胞状态（样本A1和B1中的非生发中心滤泡）和生发中心状态（样本A1、B1和D1中的亮区和暗区）的区域，去除批次效应后，基于蛋白质重叠分数和转录组谱进行聚类分析（图4A-B）。

利用扩散伪时间 (DPT) 方法，基于转录组谱和蛋白质重叠分数推断了伪时间轨迹，揭示了B细胞状态转变的两种时空模式（图4A-C）。基于RNA表达，他们在非GC滤泡聚类内推断出一条轨迹，揭示了两个主要亚群，反映了幼稚B细胞略有不同的激活状态。在该模型中，暗区和亮区的伪时间值相似，暗区的伪时间值略高。相比之下，基于蛋白质重叠分数获得的轨迹呈现出不同的进展路径，从非GC滤泡开始，穿过暗区延伸至亮区。RNA伪时间分析区分的两个幼稚B细胞亚群，在基于相互作用强度的轨迹中并未得到区分。然而，他们观察到从非GC滤泡到GC区域（暗区和亮区）的明显过渡，其中亮区表现出最高的伪时间值，这与发现的网络复杂性和聚类内 B 细胞功能状态之间存在正相关性的结果相一致。

为了表征B细胞状态转变过程中蛋白质相互作用的动态变化，他们选择基于蛋白质重叠分数的轨迹作为后续分析的参考。只有通过Fisher精确检验且在每个样本中至少一个选定聚类中阳性斑点比例大于0.15的蛋白质对才保留。根据这些标准，他们一致地鉴定了22个同源二聚体对和24个异源二聚体对（图4D）。为了表征这些同源二聚体对的特性，使用样本A1量化了每个蛋白质中同源二聚体衍生的蛋白质丰度对空间斑点中总蛋白质丰度的贡献。对于大多数蛋白质，同源二聚体衍生的信号仅占总蛋白质丰度的一小部分。相比之下，包括IgM、IgG、CD35和CD9在内的一部分蛋白质显示出来自同源二聚体PLA对的相对较高的贡献。已知这些蛋白质可通过多价配体结合或膜微区组织形成同源二聚体或更高级的聚类状结构，这表明观察到的同源二聚体信号可能反映了同源二聚体或聚类状结构的状态。此外，同源二聚体PLA信号与空间位点上的蛋白质总丰度呈强相关性，表明同源二聚体的强度很大程度上与蛋白质表达量成正比。由于蛋白质丰度已进行分析，因此在后续的相互作用分析中未对同源二聚体对进行进一步分析。

根据既往文献，他们将异二聚体进一步分为证据充分、生物学合理和推测性较强的类别，随后沿伪时间轨迹对各聚类进行比对。虽然大多数整合素介导的蛋白质相互作用并未表现出明显的聚类特异性，但少数异二聚体展现出独特的分布模式（图4E）。例如，CD19-CD21和CD20-CD32特异性富集于非生发中心滤泡中，而CD21-CD35则在亮区和暗区更为常见。CD19-CD21和CD21-CD35的独特分布与其在B细胞活化和B细胞成熟中的既定作用相符，进一步支持了使用Sprox-seq进行蛋白质复合物读数的准确性。此外，构成这些异二聚体的蛋白质的表达也沿轨迹排列（图 4F）。CD19 在非生发中心滤泡中富集，而 CD21 在亮区表达更为丰富。这些富集模式并不总是与其相应蛋白质复合物的相互作用强度一致。单个蛋白质表达与其相关相互作用之间的空间差异进一步表明，仅测量蛋白质丰度的技术无法直接推断蛋白质相互作用模式。

为了进一步研究这些相互作用的生物学意义，他们将Sprox-seq数据与先前发表的人类扁桃体单细胞RNA测序数据集整合，并使用Tangram对样本A1进行斑点反卷积（图5A）。然后，他们定量了空间聚类中每种预测细胞类型的相对比例（图5B）。与空间注释一致，幼稚B细胞在非GC滤泡中富集，而生发中心B细胞是暗区和亮区的主要细胞群。为了确定与特定蛋白质相互作用相关的细胞环境，他们对所有空间位点的重叠分数与预测细胞类型比例进行了相关性分析。与它们在非GC滤泡中的富集一致，CD19-CD21相互作用强度与幼稚B细胞比例呈显著正相关（图5C-D）。同样，与它们在生发中心的空间定位一致，CD21-CD35相互作用强度与GC B细胞比例也显著相关（图5E-F）。相比之下，CD20-CD32相互作用强度与记忆B细胞的相关性最强（图5G-H）。在样本B1中也观察到了类似的结果。

由于空间反卷积分析将表面蛋白质相互作用与特定细胞类型联系起来，他们接下来探究这些空间富集的相互作用是否与不同的转录程序相关，从而揭示其生物学功能。为了探究这一点，将蛋白质复合物的读数与来自相同空间位置的转录组数据整合。与GC B细胞密切相关的CD21-CD35复合物在扁桃体暗区和亮区均显著富集，而非生发中心滤泡则相对较少（图6A-C）。对样本A1生发中心内CD21-CD35相互作用高低不同的区域进行了差异基因表达分析，鉴定出278个上调基因和97个下调基因，表明RNA表达发生了显著变化（图6D）。在排名前20位的上调基因中观察到了多种细胞周期调控因子，包括CENPF、PLK1、KIF20A、TTK、SPC24、NEK2和H3C7（图6E）。对CD21-CD35高相互作用位点中所有上调基因进行通路富集分析，结果显示E2F靶点、G2/M期检查点、有丝分裂纺锤体、mTORC1信号通路和DNA修复通路显著富集（图6F），表明CD21-CD35相互作用与细胞有丝分裂呈正相关。同样，对样本B1进行的通路富集分析也显示，CD21-CD35高相互作用与活跃的细胞增殖状态呈正相关。

与幼稚B细胞群的强相关性一致，CD19-CD21在非生发中心滤泡中显著富集。然而，高相互作用点和低相互作用点之间的差异基因表达分析显示RNA表达无显著变化，这可能是因为这种相互作用分布于大多数幼稚B细胞中，而幼稚B细胞正是启动B细胞活化的细胞。CD20-CD32相互作用强度与记忆B细胞丰度呈显著正相关（图5G-H）。事实上，记忆B细胞比例和CD20-CD32相互作用强度的空间可视化结果显示，在样本A1和B1的组织切片中，二者的分布模式相似。这些结果表明，CD20-CD32相互作用并非特异性地富集于特定区域，而是广泛分布于GC以外的组织中。这与已知的记忆B细胞空间分布相符。重要的是，每个聚类中预测的记忆B细胞比例中位数通常低于0.3，表明在大多数空间区域，记忆B细胞的细胞组成占比低于30%。因此，他们没有将区域进一步细分为高相互作用组和低相互作用组进行基因关联分析。

Sprox-seq技术能够保留天然组织结构和完整的细胞间相互作用。在抗体库中，整合素VLA-4的两个亚基ITGA4和CD29以及VCAM1在B细胞和FDC之间形成经典的跨细胞相互作用，并已证实能够调节免疫细胞的黏附、定位和存活。VLA-4在活化的T细胞和B细胞上高表达，而VCAM1主要在FDC上表达。在三个生物学重复实验中，VCAM1在生发中心亮层显著富集（图2E），而ITGA4和CD29则广泛分布于GC外（图7A-C）。由于它们在不同细胞类型中具有独特的表达模式，这些蛋白之间发生顺式相互作用的可能性很低。对 ITGA4-VCAM1和 CD29-VCAM1 相互作用的空间分析表明，在所有三个样本中，亮区富集程度最高，这与该区域的 B 细胞-FDC 相互作用一致（图7D-G）。

为了评估 ITGA4 在亮区的相互作用特异性，他们将所有 ITGA4 参与的蛋白对的相互作用强度与在暗区域检测到的强度进行了比较。ITGA4-VCAM1 相互作用的差异最大，表明 ITGA4 在亮区与 VCAM1 具有最强的相互作用特异性（图 7H）。综上所述， VLA-4-VCAM1 连接的跨细胞特性、互斥的空间表达模式以及在已知相互作用位点的空间限制性富集，均支持 Sprox-seq 技术能够直接捕获完整组织中介导细胞间通讯的蛋白质相互作用。

本研究提出了一种Sprox-seq技术，用于同时分析表面蛋白、蛋白复合物和mRNA，并记录每种分子的组织定位。Sprox-seq 对人类扁桃体和GC的 32 种蛋白质、528 个成对相互作用以及数千个 mRNA 进行了空间分辨率分析。组织范围内的蛋白质相互作用图谱重现了 RNA 定义的组织结构，同时也揭示了亮区域更高的相互作用复杂性。蛋白质相互作用轨迹揭示了一种不同于 RNA 推断的 B 细胞状态转变。整合的蛋白质复合物和 mRNA 分析将空间富集的复合物与有丝分裂通路联系起来。Sprox-seq 还捕获了细胞间相互作用，例如由受体复合物 VLA-4-VCAM1 介导的 B 细胞-滤泡树突状细胞相互作用。Sprox-seq 提供细胞状态的空间分辨多模态视图，并可对跨组织的蛋白质和细胞相互作用进行综合研究。